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双分子荧光互补技术效劳

2017-06-27
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会见量：

一、技术简介

BiFC是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目的卵白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。。。。

美高梅建设和完善了PROTAC生物筛选与测试平台，，，，美高梅生物部具有成熟的PROTAC功效检测及验证技术，，，，使用融合卵白表达及双荧光分子互补（BiFC)等技术，，，，建设了高通量PROTAC 筛选平台，，，，用以筛选靶向降解致病卵白的PROTAC小分子。。。。

有报道在GFP的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源卵白而不影响GFP的荧光活性，，，，BiFC技术正是使用该荧光卵白家族的这一特征，，，，将荧光卵白支解成两个不具有荧光活性的分子片断，，，，再划分与目的卵白毗连。。。。若是两个目的卵白由于有相互作用而靠近，，，，就使得荧光卵白的两个分子片断在空间上相互靠近，，，，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。。。。在荧鲜明微镜下，，，，就能直接视察到两目的卵白是否具有相互作用，，，，并且在最靠近活细胞心理状态的条件下视察到其相互作用爆发的时间、位置、强弱、所形成卵白复合物的稳固性，，，，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，，，，这些信息对研究卵白质相互作用有主要意义。。。。

厥后生长出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，，，，不但能同时检测到多种卵白质复合体的形成，，，，还能够对差别卵白质间爆发相互作用的强弱举行较量.这项技术不需要特殊的装备，，，，相互作用的卵白也不需要特别的理论配比。。。。因此，，，，BiFC技术已被国际上众多实验室接纳，，，，在活细胞内证实卵白质的相互作用。。。。本实验室乐成应用该技术研究转录因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神经元中的竞争性相互作用。。。。

BiFC技术以下几个特点使其关于研究卵白质相互作用具有奇异的优势：

1、能在显微镜下直接视察到卵白相互作用并且不依赖于其它次级效应；；；；；2、该相互作用可以在活细胞中举行视察，，，，扫除了由于细胞裂解或牢靠可能带来的假阳性效果；；；；；3、卵白质在近似心理条件的情形下表达，，，，表达水平及特征如翻译后修饰极大地靠近于内源卵白；；；；；4、不需要卵白质有特别的理论配比，，，，能检测到差别亚群卵白质间的相互作用；；；；；5、多色BiFC技术不但能同时检测到多种卵白质复合体的形成，，，，还能够对差别卵白质间爆发相互作用的强弱举行较量；；；；；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，，，，不要求特殊的装备。。。。

实验简朴、快捷、直观，，，，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与生长一定会为卵白质组学、卵白质相互作用连锁图的建设带来福音. 可是，，，，该技术与大多检测卵白质相互作用的技术一样，，，，也保存着假阴性和假阳性的问题，，，，需要在实验中仔细验证。。。。

二、实验办法

1. 将目的基因插入到含有N片断或C片断的载体中，，，，构建成融合卵白表达载体

2. 转染细胞，，，，荧鲜明微镜下视察是否有相互作用。。。。

三、应用实例

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Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Student’s t test, p<0.05.

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